构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表

0 引言 Introduction

20 世纪90 年代， LANGER 和VACANTI 提出的组织工程概念为器官移植提供了潜在无限的自体组织供应[1-3]。经过多年的努力，组织工程技术取得了很大进步，逐步进入临床应用研究，但移植早期未能得到足够的血液供应，是目前组织工程组织移植失败的重要因素之一。工程组织难以实现血管化成为制约其临床应用的关键因素。

血管化是组织移植后在宿主体内存活且维持功能的关键[4]。研究者们提出许多策略试图解决此问题，主要包括添加种子细胞，如内皮细胞、内皮祖细胞等可分泌血管内皮生长因子的细胞；添加血管生成相关因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子[5-10]；改进支架材料，如改造天然支架、3D 打印技术设计的新型支架等[11-12]。虽然这些研究取得了一定的进展，但其形成的血管网络不稳定，影响了移植物的存活。

预血管化策略成为了组织工程血管化研究热点，使用细胞膜片技术构建预血管化组织是研究热点之一。细胞膜片技术由日本学者OKANO 等[13-14]发明，该项技术具备许多优势，可以免去因使用胰蛋白酶消化给细胞带来伤害的过程，保留细胞外基质等结构[15]，而且在维持细胞良好功能及提高细胞利用率中具有绝对优势[16-17]。利用自体细胞构建细胞膜片已被应用于多项组织工程，包括食管、角膜、心脏、牙周韧带等[18-21]。SHIMIZU 等[22]发现，如果叠加细胞膜片的层数超过3 层其上层的膜片将会死亡。有学者发现细胞膜片共培养体系有利于工程化组织在体外形成内皮血管网络。ASAKAWA 等[23]尝试将人真皮成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells，UVECs) 及二者共培养形成细胞膜片，分别以不同形式、不同顺序叠加构建成3 层结构，结果显示所在的3 层结构中都能形成血管网。SASAGAWA 等[24]在成肌细胞膜片上种植人UVECs，发现在体外人UVECs 能形成血管化网络结构；接下来又将该膜片复合内皮细胞构建成“三明治”结构，发现内皮细胞能在各层膜片间形成连接且形成血管网络，进一步植入体内后的结果显示，移植物中出现新的血管网，并且与宿主血管形成吻合构成具有功能的血管网络。目前已知细胞膜片与内皮细胞共培养能在体外形成血管网络，植入体内能够加快组织工程化组织血管化进程。干细胞膜片为UVECs 的增殖、迁移、重排和血管形成提供了适宜微环境[25-26]，但是预血管化细胞膜片在血管化过程中如何发挥作用尚不清楚。众所周知，在新生血管形成过程中细胞因子调控发挥着重要作用，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等血管形成相关因子，其增高可促进UVECs 的迁移、增殖和血管形成[27-28]。

实验在体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，经抗坏血酸作用制备干细胞膜片，加入UVECs 共培养构建预血管化细胞膜片，探索干细胞膜片与兔UVECs 共培养形成血管网络过程中血管形成相关因子基因表达变化，为进一步探究预血管化细胞膜片体外血管网络形成的作用机制提供理论基础，为预血管化细胞膜片应用于组织工程血管化领域提供理论基础。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年1 至10 月在广东省人民医院医学研究中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 普通级雄性新西兰大白兔4 只，约1 月龄，体质量1.0-1.5 kg，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2011-0015。所有动物实验均按照广东省人民医院(广东省医学科学院)医学伦理研究委员会的要求操作(粤医科伦理A )。

1.3.2 主要细胞与试剂 兔UVECs(普诺赛，武汉，CP-Rb036)；兔BMSCs 完全培养基、兔BMSCs 成脂诱导分化培养基、兔BMSCs 成骨诱导分化培养基(Cyagen，USA)；兔UVECs 专用培养基(普诺赛，武汉)；0.25%胰酶-EDTA、a-MEM 培养基、澳洲胎牛血清(Gibco，USA)；青霉素-链霉素-两性霉素B 混合溶液(三抗)、抗坏血酸、二甲基亚砜DMSO(Sigma， USA)；苏木精染液、番红染液、伊红染液、Masson 丽春红酸性染液(谷歌生物公司)；鼠抗兔CD90、鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45、鼠抗兔CD34(Invitrogen，USA)；鼠抗兔CD31 一抗(Novus，USA)；羊抗鼠 IgG 二 抗 (ThermoFisher，USA)；RNAiso Plus RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒(RR036A)、荧光定量试剂盒(DRR420A)(TaKaRa，Japan)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔BMSCs 的分离培养 使用全骨髓贴壁方法体外分离、培养兔BMSCs。空气栓塞法处死兔子，置于超净工作台内；消毒兔子腹部及下肢，逐层分离下肢皮肤、肌肉，暴露股骨；分离股骨，剔除肌肉、筋膜等多余组织；使用咬骨钳咬断股骨远端，使用a-MEM 培养基冲洗骨髓腔；使用200 目过滤网过滤骨髓腔，收集过滤液放入15 mL离心管内，常规离心(常温，1 000 r/min 离心5 min)；弃上清，加入兔BMSCs 完全培养基，重悬细胞，转移至T25 培养瓶；将培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养；3 d 后首次换液，保留贴壁细胞，随后每3 d 更换培养基；镜下观察细胞形态及生长变化，至细胞生长至覆盖培养面80%左右时进行冻存或传代。

文章来源：《材料热处理学报》 网址: http://www.clrclxbzz.cn/qikandaodu/2021/0122/454.html